Seminar Hasil Penelitian • Departemen Biokimia FMIPA IPB

Aktivitas Hemaglutinasi dan Fraksinasi Protein Teripang Bohadschia marmorata asal Pulau Tidung

Hemagglutination Activity and Protein Fractionation of the Sea Cucumber Bohadschia marmorata from Tidung Island

¹ Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB University, Bogor, Indonesia

² Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB University, Bogor, Indonesia

³ Pusat Riset Biomassa dan Bioproduk (PRBB), Badan Riset dan Inovasi Nasional (BRIN), Cibinong, Indonesia

*Penulis korespondensi: msafithri@apps.ipb.ac.id | Peneliti: 1krisdiantoro@apps.ipb.ac.id

Aktivitas Spesifik Tertinggi

12.421,1 HU/mg

Bohadschia marmorata • 111,8× lipat H. atra (Titer 1:256, MHC 1,61 μg/mL)

Profil Subunit SDS-PAGE

~46–48 & ~40 kDa

Dua subunit protein dominan & 1 pita minor oligomerik ~80–85 kDa

Partisi Bimodal FPLC

Puncak A Titer 1:16

Efluen Flow-Through sebagai fraksi fungsional utama bebas garam NaCl & lendir FCS

01. Abstrak & Pendahuluan

Latar Belakang Biomedis

Abstrak

Protein pengikat karbohidrat (lektin dan hemaglutinin) dari teripang (Holothuroidea) memiliki potensi biomedis sebagai agen pengenal glikan. Penelitian ini bertujuan menganalisis aktivitas hemaglutinasi protein dari tiga spesies teripang asal Pulau Tidung (Bohadschia marmorata, Holothuria atra, dan Stichopus horrens), dilanjutkan dengan analisis fraksi ekstrak protein dari sampel teripang terpilih menggunakan SDS-PAGE dan kromatografi penukar anion kuat (HiTrap Q HP 5 mL). Protein diekstraksi menggunakan bufer Tris-HCl dingin (pH 7,6), dipresipitasi dengan amonium sulfat 70%, didialisis (10 kDa MWCO), dan diuji terhadap suspensi eritrosit kelinci 2%.

Ketiga spesies teripang menunjukkan aktivitas hemaglutinasi, dengan Holothuria atra menghasilkan rendemen protein tertinggi (2,880 mg/g jaringan basah), sedangkan B. marmorata terpilih sebagai kandidat unggulan karena memiliki aktivitas spesifik hemaglutinasi tertinggi (12.421,10 ± 5.504,32 HU/mg; titer 1:256). Analisis SDS-PAGE pada kandidat terpilih B. marmorata mengidentifikasi profil subunit yang didominasi oleh dua pita mayor pada ~46–48 dan ~40 kDa serta satu pita minor pada ~80–85 kDa. Kromatografi penukar anion kuat HiTrap Q HP 5 mL memisahkan B. marmorata menjadi fraksi tak terikat flow-through (Puncak A; titer 1:16; 580,42 HU/mg) dan fraksi terelusi garam (Puncak B; titer 1:4), yang menunjukkan efluen flow-through sebagai fraksi protein hemaglutinin fungsional utama dengan potensi hemaglutinasi tertinggi.

Kata Kunci: Bohadschia marmorata, hemagglutinin, HiTrap Q HP FPLC, iso-lectins, protein fractionation.

Pendahuluan & Konsep Biomedis

Lektin merupakan protein non-imunologis yang mengikat motif karbohidrat kompleks secara spesifik dan multivalen, sehingga berpotensi mengenali antigen karbohidrat terkait tumor (tumor-associated carbohydrate antigens / TACAs) serta memicu apoptosis sel kanker secara selektif. Teripang memanfaatkan molekul pengenal pola ini dalam sistem imunitas bawaan mereka.

Perbesar

Skema Konsep Lektin Teripang: Lektin bioaktif diekstraksi dari dinding tubuh teripang, dikarakterisasi daya ikat multivalennya melalui aglutinasi eritrosit kelinci (TRBC 2%), dan difraksinasi menggunakan FPLC untuk memetakan partisi fungsionalnya.

01B. Mekanisme Hemaglutinasi & Hubungannya dengan Riset Kanker

Onkologi Glikobiologi Tervalidasi

02. Metode & Diagram Alur Riset Interaktif

Protokol Eksperimental Lengkap

Penjelajah Alur Penelitian Interaktif (Langkah-demi-Langkah)

Pilih tahapan riset di bawah ini untuk melihat rincian protokol analitis, rasional biokimia, dan tombol pintas ke data eksperimen terkait:

Diagram Alir Metodologi Penelitian

Perbesar

03. Rendemen Ekstraksi & Aktivitas Hemaglutinasi 3 Spesies Teripang

Hasil Skrining

Tabel 1. Profil Ekstraksi, Kadar Protein Bradford (rerata ± SD, n = 3), dan Aktivitas Hemaglutinasi (duplo, n = 2) Tiga Spesies Teripang Pulau Tidung

Spesies Teripang	Famili	Bobot Pelet (g)	Kadar Protein (mg/mL)	Rendemen (mg/g)	Titer HA (TRBC 2%)	Aktivitas Spesifik (HU/mg)	MHC (μg/mL)
Bohadschia marmorata	Holothuriidae	5,226	0,412 ± 0,183	0,103	1:256	12.421,10 ± 5.504,32	1,61 (~0,08 μg/sumur)
Holothuria atra	Holothuriidae	9,749	11,520 ± 0,744	2,880 (Tertinggi)	1:64	111,12 ± 7,17	180,00 (~9,00 μg/sumur)
Stichopus horrens	Stichopodidae	1,035	0,918 ± 0,425	0,153	1:32	697,18 ± 322,69	28,69 (~1,43 μg/sumur)

*Catatan: Rendemen dihitung dari rasio massa protein terlarut pasca-dialisis per 60,0 g bobot basah dinding tubuh. Pengujian duplo (n = 2) dalam bufer Tris-HCl tanpa suplementasi CaCl₂ eksogen. Aktivitas volumetrik B. marmorata = 5.120 HU/mL.

Dokumentasi Eksperimen Asli (Gambar 1 & 2 Poster)

Perbesar

Gambar 1 & 2: (Kiri) Diagram rendemen protein dinding tubuh (tertinggi pada H. atra) dan aktivitas spesifik hemaglutinasi (tertinggi pada B. marmorata). (Kanan) Pola aglutinasi hamparan sel darah merah kelinci (TRBC 2%) pada plat mikrotitrasi 96-well dasar-V hingga sumur 1:256 dengan nilai MHC 1,61 μg/mL.

Analisis Komparatif Bioaktivitas: H. atra menghasilkan perolehan pelet dan rendemen protein terekstraksi tertinggi (2,880 mg/g; 11,520 ± 0,744 mg/mL) yang didominasi protein struktural. Sebaliknya, B. marmorata memiliki aktivitas spesifik hemaglutinasi mencapai 12.421,10 ± 5.504,32 HU/mg, yaitu 111,8× lebih tinggi dari H. atra dan 17,8× lebih tinggi dari S. horrens dengan MHC terendah (1,61 μg/mL), menjadikannya kandidat unggulan untuk karakterisasi dan fraksinasi lebih lanjut.

Simulator Plat 96-Well Interaktif

Sentuh sumur untuk simulasi respons eritrosit kelinci (TRBC 2%)

👉 Geser horizontal untuk melihat Sumur 1 s.d. 12

← Konsentrasi Protein Tinggi Mat (Positif) Button (Negatif) Kontrol Blangko →

Bohadschia marmorata

Sumur 8

Faktor Pengenceran: 1:256

TITIK AKHIR TITER

Titer Hemaglutinasi 1:256

Aktivitas Spesifik 12.421,10 HU/mg

MHC (Konsentrasi Min.) 1,61 μg/mL

Massa Protein Sumur Ini ~0,08 μg

Mempertahankan aglutinasi hingga sumur 8 (1:256) dengan konsentrasi hemaglutinasi minimum (MHC) 1,61 μg/mL (~0,08 μg protein per sumur), membuktikan afinitas pengikatan eritrosit yang sangat peka.

04. Profil Bobot Molekul Subunit Protein (SDS-PAGE)

Elektroforesis Gel

Gambar 3. Elektroforegram SDS-PAGE Ekstrak Kasar B. marmorata

Perbesar

Gambar 3: Profil subunit protein terlarut memperlihatkan dua pita mayor berintensitas tajam pada ~46–48 kDa dan ~40 kDa, serta satu pita minor berintensitas lebih rendah pada ~80–85 kDa.

Analisis Pita Subunit Protein

Pilih subunit protein untuk menampilkan identitas bobot molekul dan penjelasan biokimiawinya:

Analisis Pola Subunit Protein: Pola pita serupa pada kedua lajur sampel (L1 dan L2) menunjukkan keberadaan beberapa komponen protein dengan bobot molekul berbeda dalam ekstrak hasil dialisis. Profil tersebut memberikan gambaran awal komposisi subunit protein B. marmorata yang didominasi oleh dua pita mayor pada rentang bobot molekul sedang serta satu pita minor pada rentang bobot molekul tinggi (~80–85 kDa).

05. Fraksinasi FPLC HiTrap Q HP 5 mL & Partisi Bimodal

Kromatografi Penukar Anion Kuat

Gambar 4. Kromatogram ÄKTA go & Plat Penapisan Fraksi (Asli Poster)

Perbesar

Gambar 4: Kromatografi penukar anion kuat resolusi tinggi memisahkan ekstrak B. marmorata menjadi dua puncak absorbansi UV280 nm utama: Puncak A (Flow-Through; apeks 3,43 mL; 31,62% area UV; titer 1:16) dan Puncak B (Elusi Gradien 0–1,0 M NaCl; apeks 56,42 mL, Fraksi 6–16; 62,77% area UV; titer 1:4).

Inspektur Puncak Kromatogram FPLC Interaktif

Pilih fraksi FPLC untuk menginspeksi parameter serapan UV280, konduktivitas, dan titer hemaglutinasinya:

Mengapa Flow-Through Memiliki Titer Tertinggi (1:16)?

Lektin dinding tubuh B. marmorata pada efluen flow-through memiliki titik isoelektrik netral/basa (pI ≥ 7,6) sehingga tidak bermuatan negatif bersih pada bufer Tris-HCl pH 7,6 dan langsung lolos tanpa terikat matriks kationik kuaterner amonium. Sementara itu, lendir dinding tubuh yang kaya akan glikosaminoglikan polianionik fucosylated chondroitin sulfate (FCS) bermuatan sulfat masif (-SO₃⁻) tertahan kuat pada matriks kolom. Dengan demikian, kolom HiTrap Q HP bertindak efektif sebagai negative chromatography filter yang membebaskan lektin fungsional pada flow-through dari kontaminan lendir endogen!

Tabel 2. Parameter Kromatografi Penukar Anion Kuat HiTrap Q HP 5 mL (ÄKTA go) dan Profil Aktivitas Hemaglutinasi Fraksi B. marmorata

Puncak / Fraksi	Deskripsi Fase & Volume Retensi	Luas Area UV280 (mAU·mL & %)	Konduktivitas (mS/cm)	Respons Hemaglutinasi (TRBC 2%)
Puncak A (Flow-Through)	Efluen tidak terikat; apeks 3,43 mL (pool 21,91 mL)	222,056 mAU·mL (31,62%)	4,02 mS/cm	Positif (+) [Titer 1:16]
Puncak B (Elusi Gradien)	Fraksi terikat elusi 0–1,0 M NaCl; apeks 56,42 mL (Fraksi 6–16, pool 55,01 mL)	440,782 mAU·mL (62,77%)	37,95 mS/cm	Positif (+) [Fraksi 7–16 aktif; Titer 1:4 (Apeks F9–F10)]
Fase Akhir Gradien	Desorpsi konduktivitas tinggi pada akhir gradien (~0,82 M NaCl); retensi 101,45 mL (pool 10,80 mL)	39,343 mAU·mL (5,60%)	68,72 mS/cm	Aktivitas meluruh [Fraksi 18 Titer 1:2]

Tabel 3. Profil Konsentrasi Protein Bradford Pasca-ÄKTA dan Parameter Bioaktivitas Hemaglutinasi Fraksi B. marmorata

Puncak / Fraksi ÄKTA go	Kadar Protein (μg/mL)	Titer Hemaglutinasi	Aktivitas Volumetrik (HU/mL)	Aktivitas Spesifik (HU/mg)	MHC (μg/mL)
Puncak A (Flow-Through)	551,33	1:16	320	580,42	34,46 (~1,72 μg/sumur)
Fraksi 9 (Awal Puncak B)	<LOQ*	1:4	80	—	—
Fraksi 10 (Lereng Naik)	328,44	1:4	80	243,58	82,11
Fraksi 11 (Apeks Puncak B)	412,67	1:4	80	193,86	103,17
Fraksi 12 (Lereng Turun)	272,11	1:4	80	294,00	68,03
Fraksi 18 (Akhir Gradien)	<LOQ*	1:2	40	—	—

Keterangan: TRBC 2% dalam bufer Tris-HCl pH 7,2. Aktivitas volumetrik = Titer / 0,050 mL. Aktivitas spesifik = Aktivitas Volumetrik (HU/mL) / Konsentrasi Protein (mg/mL). MHC = Konsentrasi Protein (μg/mL) / Titer. (*) Nilai absorbansi Fraksi 9 (A595 = 0,4613) dan Fraksi 18 (A595 = 0,4662) berada di bawah batas kuantifikasi analitis (<LOQ) karena setara sinyal latar bufer blangko triplo (A595 = 0,4693); rasio aktivitas spesifik dan MHC tidak dikalkulasi guna menghindari artifak numerik pembagian.

06. Simpulan & Saran Tahap Lanjutan

Rekomendasi Riset

Simpulan Penelitian

Aktivitas hemaglutinasi protein pada ketiga spesies teripang asal Pulau Tidung menunjukkan bahwa seluruh spesies memiliki potensi aglutinasi eritrosit, dengan Bohadschia marmorata terpilih sebagai kandidat unggulan karena memiliki aktivitas spesifik hemaglutinasi tertinggi (12.421,10 ± 5.504,32 HU/mg; titer 1:256; MHC 1,61 μg/mL) melampaui S. horrens (697,18 HU/mg) dan H. atra (111,12 HU/mg).
Hasil fraksinasi protein menggunakan elektroforesis SDS-PAGE pada kandidat terpilih B. marmorata mengidentifikasi profil subunit yang didominasi oleh dua pita mayor pada rentang bobot molekul sedang (~46–48 kDa dan ~40 kDa) serta satu pita minor pada rentang bobot molekul tinggi (~80–85 kDa).
Fraksinasi lanjutan menggunakan kromatografi penukar anion kuat HiTrap Q HP 5 mL menunjukkan efluen flow-through (Puncak A) sebagai fraksi protein hemaglutinin fungsional utama dengan potensi hemaglutinasi tertinggi (titer 1:16; aktivitas spesifik 580,42 HU/mg) yang bebas dari gangguan garam NaCl dan lendir polianionik endogen.

Saran & Rekomendasi Riset Lanjutan

Desalting & Kontrol Kekuatan Ionik: Melakukan pengujian konfirmasi aktivitas hemaglutinasi pada fraksi kromatografi pasca-penghilangan garam (desalting) dengan kontrol kekuatan ionik bertingkat guna mengeliminasi efek kontak antarseluler non-spesifik (pseudoaglutinasi) pada Puncak B.
Uji Titrasi Kalsium / EDTA: Melakukan uji titrasi penambahan Ca²⁺ eksogen dan kelator kation EDTA untuk membuktikan secara definitif independensi kofaktor ion kalsium.
Uji Penghambatan Hemaglutinasi (HIA): Menjalankan hemagglutination inhibition assay menggunakan panel monosakarida dan glikoprotein spesifik untuk mengidentifikasi kantung pengenal gula lektin.
Pemurnian Homogen & LC-MS/MS: Melanjutkan pemurnian hingga homogen (kromatografi filtrasi gel atau kromatografi afinitas gula) yang dilanjutkan dengan identifikasi sekuens protein menggunakan Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS).